血涂片制備與染色
血涂片是通過特定的方法將血液按一定方向均勻涂開的過程,微觀上使細(xì)胞是由球形變?yōu)槠矫嫘位蚪矫嫘纹戒佋谳d玻片上。血涂片的顯微鏡檢查是血液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的基本步驟,特別是對(duì)于各種血液病的診斷和鑒別診斷,具有重要價(jià)值。 血涂片制備是否合格、染色的好壞直接關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量。
(一)血涂片制備
1. 載玻片的準(zhǔn)備
新載玻片常帶有游離堿質(zhì),須用濃度為 lmol/L 的HCl浸泡24h,再用清水*沖洗,干燥后備用。舊載玻片要用含洗滌劑的清水中煮沸20min,洗掉血膜,再用清水反復(fù)沖洗,zui后用0.95L/L乙醇浸泡1h,干燥備用。使用載玻片時(shí),不要用手觸及玻片表面,保持玻片清潔、干燥、中性、無油膩。
2.血涂片制作方法
取血液標(biāo)本一滴置載玻片的一端,以邊緣平滑的推片一端,從血滴前沿方向接觸血液,使血液沿推片散開,推片與載玻片保持 30~45 度夾角,平穩(wěn)地向前推動(dòng),血液即在載玻片上形成薄層血膜(圖1—1)。
圖 2—1 血涂片的制作步驟示意圖
涂片的厚薄與血滴大小、推片與載玻片之間的角度、推片時(shí)的速度及血細(xì)胞比容有關(guān)。血滴大、角度大、速度快則血膜越厚;反之則血膜越薄。
一張良好的血涂片,要求厚薄適宜,頭體尾明顯,細(xì)胞分布均勻,血膜邊緣整齊并留有的空隙。
下面是幾種血涂片效果模式圖及形成原因 (圖l—2) 。
圖 2—2 幾種血涂片效果比較
(二)血涂片染色
染色的目的是使細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu),如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等染上不同的顏色,以便于鏡下觀察識(shí)別。
血涂片染色包括兩個(gè)過程:固定和染色。固定是將細(xì)胞蛋白質(zhì)和多糖等成分迅速交聯(lián)凝固,以保持細(xì)胞原有形態(tài)結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。常用的染色方法有瑞特染色法 (Wright)、姬姆薩染色法(Giemsa)等。
1.瑞特(Wright)染色法
本法的特點(diǎn)是將固定和染色合并在一起進(jìn)行,手續(xù)簡(jiǎn)便,染色時(shí)間短,對(duì)白細(xì)胞特異性顆粒著色較好,但對(duì)核的著色略差。
(1)瑞特染料
由酸性染料伊紅和堿性染料美藍(lán)組成的復(fù)合染料。伊紅為鈉鹽,有色部分為陰離子。美藍(lán)為氯鹽,有色部分為陽(yáng)離子。美藍(lán)和伊紅的水溶液混合后,產(chǎn)生一種不溶于水的伊紅化美藍(lán) (ME)中性沉淀,即瑞特染料,溶解于甲醇中,即成為瑞氏染液。甲醇的作用一方面使ME溶解,并解離為M + 和E - ,兩種有色離子可以選擇性地與細(xì)胞內(nèi)不同成分結(jié)合。另一方面因其具有強(qiáng)大的脫水作用,可將細(xì)胞瞬間固定,蛋白質(zhì)被沉淀為顆粒狀或者網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),表面積增加,提高對(duì)染料的吸附作用,增強(qiáng)染色效果。
(2)緩沖液
pH6.4~6.8的磷酸鹽緩沖液,其作用是使染色環(huán)境維持在弱酸性,達(dá)到*的染色效果。
(3)細(xì)胞的著色原理
細(xì)胞的著色既有化學(xué)的親合作用,又有物理的吸附作用。不同的細(xì)胞由于其所含化學(xué)成分不一樣,化學(xué)性質(zhì)各不相同,所以對(duì)染料的親合力也不一樣。
①細(xì)胞中的堿性物質(zhì)與酸性染料伊紅結(jié)合染成紅色,因此,該物質(zhì)又稱為嗜酸性物質(zhì)。如紅細(xì)胞中的血紅蛋白及嗜酸粒細(xì)胞中的嗜酸性顆粒等與伊紅結(jié)合。
②細(xì)胞中的酸性物質(zhì)可與堿性染料美藍(lán)結(jié)合而染成藍(lán)紫色,該物質(zhì)又稱嗜堿性物質(zhì)。如淋巴細(xì)胞胞質(zhì)及嗜堿粒細(xì)胞的顆粒為酸性物質(zhì),與堿性染料美藍(lán)結(jié)合。
③中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅美藍(lán)均可結(jié)合,染淡紫紅色為中性物質(zhì)。另外細(xì)胞核蛋白主要由脫氧核糖核酸和強(qiáng)堿性的組蛋白等組成,與酸性伊紅結(jié)合染成紅色,但因核蛋白中還含有少量的弱酸性物質(zhì),與堿性美藍(lán)作用染成藍(lán)色,因含量太少,藍(lán)色反應(yīng)極弱,故也被染成紫紅色。
④原始紅細(xì)胞和早幼紅細(xì)胞的胞質(zhì)含有較多的酸性物質(zhì),與美藍(lán)親合力強(qiáng),故染成較濃厚的藍(lán)色;隨著細(xì)胞的發(fā)育,晚幼紅細(xì)胞階段既含有酸性物質(zhì),又含有堿性物質(zhì)( Hb),既能與堿性染料美藍(lán)結(jié)合,又能與酸性染料伊紅結(jié)合,故染成紅藍(lán)色或灰紅色;當(dāng)紅細(xì)胞*成熟,酸性物質(zhì)*消失后,只與伊紅結(jié)合,則染成粉紅色。
圖 2-3 瑞特染色原理示意圖
( 4)pH對(duì)細(xì)胞染色的影響
細(xì)胞著色對(duì)氫離子濃度十分敏感。細(xì)胞各種成分均由蛋白質(zhì)構(gòu)成,由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì),所帶電荷的正負(fù)數(shù)量隨溶液 pH值而定。對(duì)某一蛋白質(zhì)而言,如果環(huán)境的pH小于其等電點(diǎn)(PI),則該蛋白質(zhì)帶正電荷即在酸性環(huán)境中正電荷增多,易與酸性伊紅結(jié)合,染色偏紅;相反,當(dāng)環(huán)境的pH大于PI即在堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多,則易與美藍(lán)結(jié)合染色偏藍(lán)。因此,要使用清潔中性的載玻片、的甲醇做溶劑和用緩沖液(pH6.4~6.8)來調(diào)節(jié)染色時(shí)的pH值,達(dá)到滿意的染色效果。
( 5)染色效果分析
正常情況:血膜外觀呈淡粉紅色或琥珀色。顯微鏡下,成熟紅細(xì)胞呈粉紅色。白細(xì)胞胞質(zhì)中顆粒清楚,并顯示出各種細(xì)胞*的色彩,細(xì)胞核染紫紅色,核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。
染色偏酸:紅細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞顆粒偏紅,白細(xì)胞核呈淡藍(lán)色或不著色。
染色偏堿:所有細(xì)胞呈灰藍(lán)色,顆粒深暗;嗜酸粒細(xì)胞可染成暗褐色,甚至紫黑色或藍(lán)色;中性顆粒偏粗,染成紫黑色。
圖 2—4 不同染色效果的細(xì)胞比較
2.姬姆薩(Giemsa)染色法
姬姆薩染料由天青和酸性染料伊紅組成的復(fù)合染料。染色原理、緩沖液與瑞特染色法大致相同。本法對(duì)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和寄生蟲著色較好,結(jié)構(gòu)顯示更為清晰,但細(xì)胞質(zhì)和顆粒著色較差。
3. 瑞-姬染色法
瑞特染色液和姬姆薩染色液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)有各自的顯色特征,前者對(duì)細(xì)胞漿和顆粒著色較好,后者對(duì)對(duì)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)顯示清晰。因此將瑞特染料和姬姆薩染料混合,甲醇溶解后組成瑞-姬染色液能取長(zhǎng)補(bǔ)短,優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),其中所使用的緩沖液與瑞特染色法相同。用該混合染液對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行染色,細(xì)胞核、細(xì)胞漿和細(xì)胞內(nèi)顆粒著色均有上佳表現(xiàn),著色鮮艷,對(duì)比鮮明,是臨床上廣泛使用的方法。
(三)血涂片染色的質(zhì)量控制
1.載玻片必須非常潔凈,中性,無油脂。不清潔或非中性的載玻片會(huì)造成細(xì)胞特別是紅細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,導(dǎo)致假性的異常形態(tài)紅細(xì)胞出現(xiàn)。非中性的載玻片還會(huì)影響染色環(huán)境的pH值,帶油脂的載玻片會(huì)使細(xì)胞分布不均勻。
2.良好血涂片的“標(biāo)準(zhǔn)”。血膜由厚到薄逐漸過度,血膜的體尾交界部位紅細(xì)胞分布均勻,既不重疊又互相緊靠相連。
3. EDTA抗凝血液制備血涂片。由于EDTA能阻止血小板聚集,如需在顯微鏡下觀察血小板形態(tài)時(shí)可采用,但EDTA抗凝血有時(shí)能引起紅細(xì)胞皺縮和白細(xì)胞聚集,所以應(yīng)根據(jù)情況恰當(dāng)選擇。
4. 白細(xì)胞較低和需濃縮白細(xì)胞的標(biāo)本處理。為獲得較多白細(xì)胞,可將抗凝血適當(dāng)離心,使密度相同細(xì)胞集中并分層,然后取紅細(xì)胞層上薄的灰白色層(有核細(xì)胞和血小板較集中)涂片、染色。該方法非常適合于白細(xì)胞減低患者的白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及紅斑狼瘡細(xì)胞檢查。
5. 血細(xì)胞比容與涂片關(guān)系。血細(xì)胞比容高于正常時(shí),紅細(xì)胞較多,血液粘度較高,用較小的角度涂片,可獲得滿意的血膜。相反,血細(xì)胞比容低于正常時(shí),血液粘度較低,需用較大角度涂片。
6.新配制的瑞氏染液處置。新配制的瑞氏染液包括瑞-姬染液,pH偏堿,染色效果不太理想,需在室溫放置一段時(shí)間,其中美藍(lán)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樘烨郆。在密封條件下,貯存時(shí)間愈久,轉(zhuǎn)化的天青B愈多,染色效果愈好。
7.染色過深、過淺的處理。染色過深、過淺與血涂片中細(xì)胞數(shù)量、血膜厚度、染色時(shí)間、染液濃度、pH值密切相關(guān)。對(duì)于重要的標(biāo)本可采用先試染的方法,根據(jù)試染效果調(diào)節(jié)第二次染色方式。糾正染色過深可縮短染色時(shí)間或稀釋染液。糾正染色過淺可延長(zhǎng)染色時(shí)間。如果標(biāo)本片有限出現(xiàn)了染色過深、過淺的情況,可用如下辦法挽救:染色過深可加少量緩沖液覆蓋血膜部分褪色,在顯微鏡下觀察褪色情況及時(shí)終止。染色過淺可重加染色液和緩沖液復(fù)染,也要在顯微鏡下觀察及時(shí)終止。
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